液相色譜系統(tǒng)的許多問題都可以在譜圖上反映出來。其中有一些問題可以通過改變設備參數(shù)得到解決;而其他的問題必須通過修改操作程序來解決。對于色譜柱和流動相的正確選擇是得到好的色譜圖的關鍵所在。
原因 |
解決辦法 |
1.篩板阻塞; |
1.a(chǎn).反沖色譜柱; b.更換進口篩板; c.更換色譜柱; |
2.色譜柱塌陷; |
2. 填充色譜柱; |
3.干擾峰; |
3. a.使用更長的色譜柱; b.改變流動相或更換色譜柱; |
4.流動相pH選擇錯誤; |
4.調整pH值,對于堿性化合物,低pH值更有利于得到對稱峰; |
5.樣品與填料表面的溶化點發(fā)生反應; |
5.a.加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑。b.更改色譜柱。 |
原因 |
解決辦法 |
1.柱溫低; |
1.升高柱溫; |
2.樣品溶劑選擇不恰當; |
2.使用流動相作為樣品溶劑; |
3.樣品過載; |
3.降低樣品含量; |
4.色譜柱損壞; |
4.見A1、A2; |
原因 |
解決辦法 |
1.保護柱或分析柱污染; |
1.取下保護柱再進行分析;如果必要更換保護柱;如果分析柱阻塞,拆下來清洗;如果問題仍然存在,可能是柱子被強保留物質污染,運用適當?shù)脑偕胧?;如果問題仍然存在,入口可能被阻塞,更換篩板或更換色譜柱。 |
2.樣品溶劑不溶于流動相; |
2.改變樣品溶劑;如果可能采取流動相作為樣品溶劑; |
原因 |
解決辦法 |
1.樣品過載; |
1.減少樣品載量; |
原因 |
解決辦法 |
1.樣品溶劑選擇不恰當; |
1. a.減少進樣體積; b.運用低極性樣品溶劑; |
原因 |
解決辦法 |
1.柱外效應; |
1. a.調整系統(tǒng)連接(使用更短、內徑更小的管路); b.使用小體積的流通池; |
原因 |
解決辦法 |
1.二級保留效應,反相模式; |
1. a.加入三乙胺(或堿性樣品); b.加入乙酸(或酸性樣品); c.加入鹽或緩沖劑(或離子化樣品); d.更換一支柱子; |
2.二級保留效應,正相模式; |
2. a.加入三乙胺(或堿性樣品); b.加入乙酸(或酸性樣品); c.加入水(或多官能團化合物); d.試用另一種方法; |
3.二級保留效應,離子對; |
3.加入三乙胺(或堿性樣品); |
原因 |
解決辦法 |
1.緩沖不合適; |
a.使用濃度50~100mM的緩沖液; b.使用P ka等于流動相pH值的緩沖液; |
原因 |
解決辦法 |
1.樣品中有其他組份; |
1.正常; |
2.前一次進樣的洗脫峰; |
2. a.增加運行時間或梯度斜率; b.提高流速; |
3.空位或鬼峰; |
3. a.檢查流動相是否純凈; b.使用流動相作為樣品溶劑; c.減少進樣體積; |
原因 |
解決辦法 |
1.溫控不當; |
1.調好柱溫; |
2.流動相組分變化 |
2.防止變化(蒸發(fā)、反應等); |
3.色譜柱沒有平衡; |
3.在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱; |
原因 |
解決辦法 |
1.流速變化; |
1.重新設定流速; |
2.泵中有氣泡; |
2.從泵中除去氣泡; |
3.流動相選擇不恰當; |
3. a.更換合適的流動相; b.選擇合適的混合流動相; |
原因 |
解決辦法 |
1.柱溫波動;(即使很小的溫度變化都會引起基線波動;通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器;) |
1.控制好柱子和流動相的溫度,在檢測器之前使用熱交換器; |
2.流動相不均勻;(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導致的漂移) |
2.使用HPLC級的溶劑(蚌埠譜銳達生物科技有限公司總代理的德國PUREDIL品牌HPLC級色譜溶劑),高純度的鹽和添加劑;流動相在使用前進行脫氣,使用中使用氦氣; |
3.流通池被污染或有氣體; |
3.用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池;如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用鹽酸) |
4.檢測器出口阻塞;(高壓造成流通池窗口破裂,產(chǎn)生噪音基線) |
4.取出阻塞物或更換管子;參考檢測器手冊更換流通池窗; |
5.流動相配比不當或流速變化; |
5.更改配比或流速;為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速; |
6.柱平衡慢,特別是流動相發(fā)生變化時; |
6.用中等強度的溶劑進行沖洗,更改流動相時,在分析前用10~20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗; |
7.流動相污染、變質或由低品質溶劑配成; |
7.檢查流動相的組成;使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑(蚌埠譜銳達生物科技有限公司總代理的德國PUREDIL品牌HPLC級色譜溶劑); |
8.樣品中有強保留的物質(高K’值)以饅頭峰樣被洗脫出,從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。 |
8.使用保護柱,如有必要,在進樣之間或在分析過程中,定期用強溶劑沖洗柱子。 |
9.使用循環(huán)溶劑,但檢測器未調整。 |
9.重新設定基線;當檢測器動力學范圍發(fā)生變化時,使用新的流動相; |
10.檢測器沒有設定在最大吸收波長處; |
10.將波長調整至最大吸收波長處; |
原因 |
解決辦法 |
1.在流動相、檢測器或泵中有空氣; |
1.流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣; |
2.漏液 |
2.見第三部分;檢查管路接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換泵密封。 |
3.流動相混合不完全 |
3.用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑 |
4.溫度影響(柱溫過高,檢測器未加熱) |
4.減少差異或加上熱交換器 |
5.在同一條線上有其他電子設備 |
5.斷開LC、檢測器和記錄儀,檢查干擾是否來自于外部,加以更正。 |
6.泵振動 |
6.在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器 |
原因 |
解決辦法 |
1.漏液 |
1.見第三部分。檢查接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封。檢查流通池是否漏液。 |
2.流動相污染、變質或由低質溶劑配成 |
2.檢查流動相的組成。 |
3.流動相各溶劑不相溶 |
3.選擇互溶的流動相 |
4.檢測器/記錄儀電子元件的問題 |
4.斷開檢測器和記錄儀的電源,檢查并更正。 |
5.系統(tǒng)內有氣泡 |
5.用強極性溶液清洗系統(tǒng) |
6.檢測器內有氣泡 |
6.清洗檢測器,在檢測器后面安裝背景壓力調節(jié)器 |
7、流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。) |
7.用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池 |
8.檢測器燈能量不足 |
8.更換燈 |
9.色譜柱填料流失或阻塞 |
9.更換色譜柱 |
10.流動相混合不均勻或混合器工作不正常 |
10.維修或更換混合器,在流動相不走梯度時,建議不使用泵的混合裝置 |
原因 |
解決辦法 |
1.流動相組成變化 |
1.重新制備新的流動相 |
2.流動相流速太低 |
2.調節(jié)流速 |
3.漏液(特別是在柱子和檢測器之間) |
3.見section 3。檢查接頭是否松動、泵是否漏液、是否有鹽析出以及不正常的噪音。如果必要更換密封。 |
4.檢測器設定不正確 |
4.調整設定 |
5.柱外效應影響 a.柱子過載 b.檢測器對反應時間或池體積響應過大 c.柱子與檢測器之間的管路太長或管路內徑太大 d.記錄儀響應時間太長 |
5. a.小體積進樣(例如:10μl而不是100μl)以1:10或1:100的比例稀釋樣品 b.減少響應時間或使用更小的流通池 c.使用內徑為0.007~0.01的短管路 d.減少響應時間 |
6.緩沖液濃度太低 |
6.增加濃度 |
7.保護柱污染或失效 |
7.更換保護柱 |
8.色譜柱污染或失效,塔板數(shù)較低 |
8.更換同樣類型的色譜柱。如果新柱子可以提供對稱的色譜峰,則用強溶劑沖洗舊柱子。 |
9.柱入口塌陷 |
9.打開柱入口,填補塌陷或更換柱子 |
10.呈現(xiàn)兩個或多個未被完全分離的物質的峰 |
10.選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果 |
11.柱溫過低 |
11.提高柱溫。除非特殊情況,溫度不宜超過75℃ |
12.檢測器時間常數(shù)太大 |
12.使用較小的時間常數(shù) |
原因 |
解決辦法 |
1.流動相污染或變質(引起保留時間變化) |
1.重新配置流動相 |
2.保護柱或分析柱阻塞 |
2.去掉保護柱進行分析。如果必要則更換保護柱。如果分析柱阻塞,可進行反沖。如果問題仍然存在色譜柱可能被強保留的污染物損壞,建議使用恰當?shù)脑偕绦?。如果問題仍然存在,進口可能阻塞了,更換入口處的篩板或更換色譜柱。 |
原因 |
解決辦法 |
1.檢測器衰減設定過高 |
1.減少衰減的設定 |
2.檢測器時間常數(shù)設定太大 |
2.設定較小的時間常數(shù) |
3.進樣量太少 |
3.增大進樣量 |
4.記錄儀連接不當 |
4.使用正確的連接 |
原因 |
解決辦法 |
1.檢測器衰減設定過低 |
1.采取較大的衰減 |
2.進樣過多 |
2.減少進樣量 |
3.記錄儀連接不正確 |
3.正確連接記錄儀 |
(文章來源:網(wǎng)絡)